Уже не фантазия - о создании анти-ВИЧ вакцины

> Статьи > Прочие материалы по медицинской тематике > Уже не фантазия - о создании анти-ВИЧ вакцины

И. Г. Сидорович
И. А. Николаева
Э. В. Карамов
Государственный научный центр – Институт иммунологии МЗ РФ

Эпидемия ВИЧ/СПИДа, первые случаи которого были описаны в 1981 году, приобрела ныне характер пандемии. За это время число инфицированных превысило более 60 миллионов человек и более 20 миллионов умерло. Несмотря на определенные успехи санитарно-просветительских мер, очевидно, что их недостаточно, чтобы сдержать распространение заболевания. Сегодня признано, что для того, чтобы остановить пандемию, необходима разработка безопасной и эффективной вакцины, и на нее направлены беспрецедентные усилия. Всего с 1986 г. в мире разрабатывалось более 400 экспериментальных вакцин, причем 40 из них были уже испытаны. В настоящее время более 30 кандидатных вакцин находятся на I–II стадиях клинических испытаний, а 2 вакцины уже более года проходят испытания на эффективность (последняя, III фаза) на нескольких тысячах добровольцев. Кроме того, есть ряд перспективных разработок, которые проходят испытания на приматах или подготовлены к началу клинических испытаний. Даже простое перечисление вакцин занимает несколько страниц, и это еще раз указывает на остроту проблемы.

Разработка вакцины против ВИЧ/СПИДа является чрезвычайно трудной задачей. Прежде всего, неясно, что может обеспечить действенную защиту (протективный иммунитет), поскольку, несмотря на сильный гуморальный и клеточный ответ, ВИЧ постоянно размножается в организме зараженных людей. Во-вторых, в результате мутаций образуются варианты вируса, способные уходить от иммунного ответа. В-третьих, вирус может долго существовать в организме в латентном состоянии в виде провирусной ДНК и впоследствии активироваться с развитием настоящего инфекционного процесса. В-четвертых, нет адекватной модели ВИЧ-инфекции на животных. Кроме того, действенная вакцина должна обеспечить иммунитет на слизистых, чтобы пресечь передачу вируса половым путем. Особенно “энергичная” вакцина требуется для защиты от внутривенного заражения.

В этой публикации мы остановимся на рассмотрении самой серьезной фундаментальной проблемы разработки вакцины против ВИЧ/СПИДа – незнании того, что может обеспечить протективный иммунитет. Будут также кратко рассмотрены основные типы разрабатываемых вакцин. Наконец, коснемся того, что делается в этом направлении в нашей лаборатории, в нашем Институте иммунологии.

Начнем с проблемы протективного иммунитета. Из наблюдения за инфицированными людьми мы знаем, что иммунный ответ при ВИЧ-инфекции/СПИДе есть, но он не становится протективным иммунитетом. Вообще говоря, при вирусных заболеваниях важную роль играют обе ветви иммунного ответа: гуморальный, прежде всего, в форме нейтрализующих антител, и клеточный, прежде всего, в форме цитотоксических лимфоцитов-киллеров (CTL). Действие нейтрализующих антител направлено на внеклеточную стадию жизненного цикла вируса, они должны предотвращать проникновение вируса в клетку, тогда как CTL узнают и убивают зараженные вирусом клетки, препятствуя выходу нового зрелого вирусного потомства. Исторически в ходе разработки вакцин против ВИЧ преимущественное развитие сначала получили препараты на основе поверхностных антигенов вируса (в частности, белков оболочки), соответственно с этим основной целью таких вакцин была выработка нейтрализующих антител, затем фокус исследований сместился на вакцины, стимулирующие образование CTL. В настоящее время разрабатываются новые подходы, призванные вызвать образование как нейтрализующих антител, так и цитотоксических лимфоцитов. В соответствии с этим все множество разрабатывавшихся и разрабатываемых вакцинных препаратов может быть разбито на три группы (таблица 1). Как здесь показано, одни препараты направлены в основном на стимуляцию гуморального, другие – клеточного ответа, а третий тип вакцин индуцирует образование того и другого.

Вот только два примера комбинированного подхода:

1) Рекомбинантный вектор (вирус оспы канареек) + рекомбинантный белок gp120

HIV/canaripox recombinant (PMC ALVAC vCP205) (prime) + gp120 subunit (Chiron SF2) (boost).

2) “Голая” ДНК + рекомбинантный белок.

Дальше всех продвинулись клинические испытания, в которых используется комбинированный подход, иными словами, комбинация разных по дизайну вакцин и разных антигенов. В результате ожидается более сильный ответ, более широкого спектра действия или более длительный. Ожидается, что разные вакцинные препараты, введенные одновременно (в одно и то же или разные места) или последовательно должны примировать иммунную систему для разных антигенов, стимулировать разные функции иммунной системы или подхлестнуть (бустировать) имеющийся ответ. Считается, что анти-ВИЧ вакцина будет работать наиболее успешно, если в ней представлены 1) разные антигены, происходящие из одного или многих штаммов; 2) разные способы презентации, стимулирующие разные эффекторы иммунной системы и 3) адъюванты, способные усилить или модулировать иммунный ответ. Комбинированный подход, иначе называемый стратегией “прайм-буст”, в настоящее время стал наиболее популярным. Как уже говорилось выше, считается, что эффективная вакцина против ВИЧ/СПИДа должна индуцировать как гуморальный (прежде всего, в форме вирус-нейтрализующих антител), так и клеточный (цитотоксические лимфоциты, CTL) ответ. Этой цели можно достичь с помощью стратегии “прайм-буст”, когда проводится две или более иммунизации, с применением препаратов различной природы (например, рекомбинантный вирус для первой иммунизации и рекомбинантный белок – для второй).

В связи с этим, включившись в работу над вакциной против ВИЧ/СПИДа, мы начали разработку препаратов для комбинированного подхода к вакцинации. В эту серию препаратов вошли ДНК-вакцина в качестве вектора, стимулирующего клеточный механизм иммунного ответа, и рекомбинантный белок, стимулирующий образование нейтрализующих антител. Предполагалось использовать эти препараты по схеме “прайм-буст”. Еще одной важной частью разработки стало применение безопасного иммуномодулятора-адъюванта – полиоксидония (ПО). Полиоксидоний – оригинальная разработка Института иммунологии. Это высокомолекулярное физиологически активное соединение с выраженной иммунотропностью. ПО представляет собой сополимер N-окиси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1б4-этиленпиперазиния бромида. Мишенями для ПО являются клетки фагоцитарной системы: моноциты и фагоциты. Взаимодействие полиоксидония с нейтрофилами и моноцитами ведет к изменению их функциональной активности, проявляющемуся в усилении синтеза цитокинов и фагоцитоза. Клетками-мишенями для полиоксидония in vitro являются прежде всего факторы естественной резистентности: моноциты/макрофаги, нейтрофилы и НК-клетки, факторы ранней защиты организма от инфекции. Поскольку развитие любого иммунного ответа начинается с клеток моноцитарно-макрофогальной системы, и так как цитокины, продуцируюмые моноцитами/макрофагами, обладают плейтропным эффектом, усиление под влиянием ПО их функциональной активности ведет к активации и клеточного, и гуморального иммунитета. При введении ПО совместно с низкими дозами антигена происходит усиление синтеза антител к этому антигену в 5–10 раз по сравнению с контролем. ПО разрешен для применения в качестве иммуностимулятора-носителя в составе вакцин и для самостоятельного применения в качестве иммуномодулятора. Препарат предназначен для восстановления иммунитета у взрослых и детей, в том числе в терапии ВИЧ-инфекции.

Первой задачей исследования стал выбор антигена с нужными свойствами. Как известно, белки оболочки ВИЧ являются главной мишенью для нейтрализующих антител, тогда как внутренние белки – р24 и р17 – относительно консервативны и содержат эпитопы для CTL и Th1 лимфоцитов. В связи с этим в качестве первого этапа разработки был приготовлен рекомбинантный химерный белок rec (24–41). Для этого была приготовлена плазмида, кодирующая аминокислотные последовательности фрагмента внутреннего белка р17, полноразмерного внутреннего белка р24 и фрагмента трансмембранного белка gp41 ВИЧ1. Этой плазмидой был трансформирован штамм E. coli. Трансформированный штамм активно экспрессировал химерный белок, который составлял не менее 20 % от общего бактериального белка штамма-продуцента. Химерный белок был выделен и очищен с помощью аффинной и ионообменной хроматографии. Белок rec (24–41) был конъюгирован с ПО, и иммуногенность белка и конъюгата была изучена на животных. При этом возникал вопрос о соответствии антигенных детерминант в составе самого химерного белка и его конъюгата аналогичным детерминантам в составе соответствующих прототипных вирусных белков.

Мышей (CBAxC57Bl) F1 иммунизировали разными дозами антигена (rec 24–41) и его конъюгата с ПО (rec 24–-41)-ПО, получали сыворотку обычным способом и с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровень сывороточных антител после первой и второй иммунизации. Введение животным антигена rec (24–41) и конъюгата (rec 24–41)-ПО индуцировало сильный гуморальный ответ на обе части химерного антигена (титры антител к р24 в ИФА составили более 200 000, а к gp41 – более 60 000). Специфичность индуцированных антител определяли с помощью иммуноблота. Антитела, возникшие в ответ на введение рекомбинантного химерного антигена, специфически взаимодействовали с соответствующими белками культурального вируса (gp41, p24 и его предшественником р55) в иммуноблоте фирмы Sanofi Pasteur, что свидетельствовало о сходстве рекомбинантного антигена с вирусным прототипом и сохранности основных антигенных детерминант.

Другим методом оценки состояния антигенных детерминант в составе химерного белка и конъюгата была серия опытов по оценке взаимодействия с этими препаратами сывороток ВИЧ-инфицированных лиц. Было показано, что антитела из сывороток ВИЧ-инфицированных специфически взаимодействуют как с химерным белком, так и с конъюгатом, в отличие от сывороток неинфицированных людей. Это явилось еще одним свидетельством сохранности ВИЧ-специфических антигенных детерминант в составе rec (24–41) и конъюгата.

Было показано, что при низких дозах (10 мкг белка rec 24–41 на животное) иммунизация антигеном в составе конъюгата с ПО позволяла получить титры антител, десятикратно превышающие титры антител, индуцированные чистым антигеном.

Иммунизированные животные в ответ на введение химерного белка развивали сильный лимфопролиферативный ответ. Антиген-специфическую пролиферацию лимфоцитов определяли отдельно для клеток лимфатических узлов и селезенки по включению [3H]-тимидина. Результаты определения приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы, индекс антиген-специфический пролиферации составил 10 для клеток селезенки и более 8 для клеток лимфатических узлов.

Следующей задачей было определение способности препарата индуцировать образование вирус-нейтрализующих антител. Мышей линии (СВА х С57 В1/6) F1, самок, весом 16–18 г иммунизировали четыре раза вакциной ВИЧРЕПОЛ. Доза при каждой иммунизации составляла 100 мкг в расчете на rec (24–41) на животное. При первой и второй иммунизации вакцину ВИЧРЕПОЛ вводили животным подкожно. Третий и четвертый раз препарат вводили внутрибрюшинно. Интервалы между первой, второй и третьей иммунизациями составляли 1 месяц, между третьей и четвертой – два месяца. Кровь собирали в стерильных условиях из шейной артерии через 7 дней и получали сыворотку как обычно. Контрольную сыворотку получали от неиммунизированных животных.

Нейтрализующую активность сыворотки определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции МТ4/ВИЧ-1, при этом использовался референс-штамм HIV-1 IIIB, активно реплицирующийся в Т лимфобластоидных клеточных линиях.

Сыворотку предварительно развели в 20 раз ростовой средой и подвергли тепловой обработке при +56 оС 30 мин для инактивации белков системы комплемента. В лунку 24-луночного планшета одновременно вносили сыворотку (конечное разведение 1:50) и вируссодержащую жидкость (100 ТСID50) в культуру клеток МТ4 (300 тыс. клеток на лунку) в ростовой среде, конечный объем составил 1 мл. Анализ выполняли в трех параллелях. Планшет инкубировали 18 часов при 37о С и 5% СО2. Планшет отмывали путем низкоскоростного центрифугирования при 1100 об/мин в течение 7 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл свежей ростовой среды. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 суток, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, синцитиеобразование). Пробы для определения концентрации вирусного антигена р24 отбирали на 3 и 5 сутки. Из лунки брали по 0,5 мл ростовой среды и замещали свежей. Концентрацию вирусного антигена р24 определяли с помощью иммуноферментного анализа (коммерческий набор “Innogenetics”, Бельгия).

Индекс нейтрализации рассчитывали по формуле:

NI= (ODNegSer – ODTestSer)/(ODNegSera – ODCellControl) х 100%

ODNegSer, ODTestSer, ODCellControl представляет собой среднее значение для трех параллельных анализируемых лунок планшета.

Индекс нейтрализации составил 54,9% при разведении иммунной сыворотки 1: 50. Таким образом, антитела, полученные у животных в ответ на иммунизацию rec (24–41), обладают вирус-нейтрализующими свойствами.

Итогом первого этапа разработки вакцины явилось создание препарата “ВИЧРЕПОЛ”, представляющего собой конъюгат химерного белка rec (24–41) c ПО, и вызывающего сильный ВИЧ-специфический гуморальный и лимфопролиферативный ответ.

Параллельно с изучением иммуногенных свойств белка rec (24–41) и конъюгата с ПО были проведены доклинические испытания вакцины “ВИЧРЕПОЛ”, которые продемонстрировали ее безопасность.

В настоящее время препарат “ВИЧРЕПОЛ” проходит контрольные испытания в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Следующий этап работы – получение ДНК-вакцины, кодирующей внутренние белки ВИЧ1, для индукции клеточного ответа (CTL). Производятся также модификации экспрессирующего вектора для получения рекомбинантного белка, содержащего новые антигенные детерминанты из белков оболочки ВИЧ и способного индуцировать нейтрализующие антитела. Совместное применение ДНК-вакцины и рекомбинантного белка по схеме “прайм-буст” позволит индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

Выполнение этой работы стало возможным благодаря финансовой поддержке Минпромнауки России в рамках Межведомственной программы “Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего”. В настоящее время в распоряжении участников разработки имеется широкий набор биотехнологических методов, налажен весь спектр генно-инженерных методов для получения и усовершенствования генетических конструкций, выделения и очистки рекомбинантных продуктов и иммунологических методов для оценки препарата. Есть возможность организовать производство рекомбинантного антигена. 16.12.2012



Посмотрите также:
Плазмолифтинг – эффективное возвращение молодости лица
Плазмолифтинг – эффективное возвращение молодости лица

  Во все времена женщины был готовы стерпеть многое ради красоты и ощущения вечной...
Виды саркомы
Виды саркомы

 Саркома представляет собой новообразование, которое может иметь разную природу. На...
Если голову покидают волосы
Если голову покидают волосы

Проблема выпадения волос знакома очень многим людям. Зачастую, волосы выпадают из-за плохого...
Развитие моторики – главная задача родителей
Развитие моторики – главная задача родителей

  Формирование личности малыша начинается с первых лет его неосознанной жизни. Ребенок...
Эндодонтическое лечение
Эндодонтическое лечение

  В последнее время в области эндодонтии наблюдается огромный прогресс. Стоматология, в...